A causa delle forti pressioni del governo e di Benito Mussolini in persona (allora capo del governo), la linea fu inaugurata alle 10 del 10 agosto 1924 da un convoglio partito dalla stazione di Porta San Paolo e composto da una locomotiva a vapore Gr 910.045, quattro vagoni, un bagagliaio ed una carrozza panoramica, a bordo del quale vi era lo stesso Mussolini. Dal giorno successivo la linea fu aperta al pubblico con l'utilizzo di dieci coppie di treni giornaliere che percorrevano la tratta in circa 50 minuti. In occasione del Natale di Roma del 21 aprile 1925 furono inaugurati l'esercizio a trazione elettrica e il doppio binario, rendendo la linea definitivamente completa e funzionale. Il tempo di percorrenza fu ridotto a 30 minuti circa. Inizialmente il convoglio era composto da 5 carrozze, per poi passare, nel 1926, a 7 carrozze dopo la constatazione dell'aumento dei passeggeri giornalieri. La linea era stata pensata per il traffico passeggeri, ma comunque vi erano a disposizione diversi carri merci.

Il periodo di maggior splendore per la ferrovia si ebbe negli anni '30, con percorrenze da 40 a 70 al giorno e partenze ogni 15 minuti circa. La ferrovia è stata una dei principali artefici dell'espansione di Ostia e del litorale romano e divenne in breve tempo il mezzo di trasporto più utilizzato dai romani che si recavano al mare. Inoltre nella città di Ostia furono edificati nei pressi della Stazione Centrale, anche l'ufficio della Posta, gli uffici del Governatorato (attuale sede del Municipio XIII) e la chiesa di Regina Pacis. Nel 1941 la STEFER (Società delle Tramvie E FERrovie elettriche) prese il posto della SEFI. La Seconda guerra mondiale, con i suoi bombardamenti sulle città di Roma e Ostia tra il 1943 e il 1944, distrusse gran parte della ferrovia (i danni maggiori ci furono da Acilia verso il litorale, dove la ferrovia fu completamente distrutta dai tedeschi) e delle infrastrutture, tra cui la stazione di Acilia e quella di Ostia. Il servizio fu alternativamente sospeso e limitato solo ad alcune zone (Ostia fu evacuata ed isolata). I convogli, invece, subirono molti meno danni, poiché riparati nelle gallerie della metropolitana in costruzione.

Immediatamente alla fine dei combattimenti a Roma, iniziarono i lavori per la riparazione della ferrovia consentendo dal 21 settembre 1944 il servizio grazie a locomotive a vapore e, dal 24 dicembre 1945, grazie alla trazione elettrica. La stazione di Ostia fu abbandonata del tutto (e successivamente demolita) a causa dei gravi danni subiti e la fermata di Ostia fu arretrata di 300 metri.

La stazione di Ostia Antica

Superato il periodo della Seconda guerra mondiale si procedette al potenziamento e all'espansione della linea. Nell'intento di portare i binari anche ad Ostia Levante, il 18 agosto 1948 fu inaugurata la stazione di Stella Polare e il 30 luglio 1949 quella di Castel Fusano. Sempre nel 1949 venne demolita la vecchia stazione centrale di Ostia (al cui posto ora si trova un luna park) e il 4 giugno 1951 venne inaugurata la nuova stazione di Lido di Ostia (centro), che fece adibire definitivamente il tratto di binari che giungeva alla stazione vecchia a scalo merci. Durante gli anni '50, data l'espansione di Ostia e la sua trasformazione a meta balneare preferita dai romani, venne aumentato il numero di treni in circolazione sui binari, con carrozze e locomotive più moderne. Nel 1955 venne inaugurata la metropolitana di Roma (attuale linea B) e fu sostituita la vecchia stazione di Magliana Ostiense con una nuova comune sia alla ferrovia Roma-Lido che alla metropolitana. Il 25 agosto 1960 fu inaugurata la stazione di Cristoforo Colombo che, con il collegamento a doppio binario con Lido di Ostia Centro, segnò la conclusione dei lavori per la ferrovia nel Lido (infatti il progettato collegamento della ferrovia con Torvaianica non fu mai realizzato). Sempre nel 1960 fu inaugurata la stazione di Tor di Valle, in prossimità del famoso ippodromo di Roma. Nell'estate del 1972, grazie all'espansione dei quartieri tra Roma e Ostia, viene aperta la fermata di Casal Bernocchi.

Per tutti gli anni a seguire la quantità di passeggeri aumentò notevolmente, grazie anche al collegamento diretto con la stazione Termini, il principale nodo di scambio per la capitale, che permise l'utilizzo della ferrovia Roma-Lido non solo ai villeggianti, ma anche ai pendolari: studenti e lavoratori. Nonostante il grande aumento di utenza, il parco treni rimase quasi totalmente quello degli anni '20 con gli ammodernamenti portati nel dopoguerra; unica eccezione le MR300, entrate in servizio nel 1976. Nel 1978 la STEFER lascia il posto all'ACoTraL (Azienda Consortile Trasporti Laziali), la quale è costretta a mandare in riparazione molte motrici rovinate dall'usura e, per sopperire alla mancanza di treni, è costretta, nel 1980, a "dirottare" alcune delle nuove motrici MA, destinate alla metropolitana, sulla Roma-Lido. Nel 1987 vengono introdotte le nuove MR500 realizzate dalla FIAT Ferroviaria e, dal 9 settembre 1989, il capolinea della Roma-Lido viene arretrato alla stazione di EUR Magliana per consentire i lavori di ammodernamento della stazione di Porta San Paolo; da questo momento cessano, senza essere mai più ripresi, i collegamenti diretti Termini - Lido.

Nel 1993 L'ACoTraL si fonde con il CTL (Consorzio pubblici servizi di Trasporto del Lazio) dando vita al CoTraL (Consorzio Trasporti pubblici Lazio) che, occupandosi dei trasporti pubblici dell'intera regione, diventa così il nuovo gestore della Ferrovia Roma-Lido. Successivamente, in fase di ammodernamento, le nuove infrastrutture delle linee metropolitane non lasciarono più posto ai vecchi convogli e fu così che quasi tutte le vecchie MR furono immesse in servizio sulla Roma-Lido. Nel 1995 furono introdotte le MR300 e nel 1998, dopo quasi dieci anni, riaprì la stazione di Porta San Paolo. Sempre in questo periodo ci furono dei lavori di ammodernamento sulla linea: iniziò la costruzione di una nuova stazione all'ingresso nord di Ostia, la Lido di Ostia Nord, venne ribassata e chiusa in galleria buona parte della tratta tra le stazioni di Acilia e Casal Bernocchi e partì la ristrutturazione delle stazioni di Ostia Antica, Acilia e Vitinia. Nel 2000 il CoTraL venne diviso in due società: le Linee Laziali SpA (poi di nuovo chiamate CoTraL) e la Metroferro SpA, che dal 2001 cambia nome in Met.Ro. SpA (Metropolitana di Roma SpA), la quale rimarrà l'unica gestrice della Ferrovia Roma-Lido (assieme alle linee A e B della metropolitana e alle ferrovie, in concessione, Roma-Pantano e Roma-Viterbo). Dal 4 giugno 2000 fanno il loro debutto su rotaia le MR600, ottenute dal disegno delle MR500 e da alcune componenti delle MR100. Un mese dopo si inaugurò la nuova stazione di Lido di Ostia Nord.

Dal 1° ottobre 2005, con l'arrivo delle nuove MA300 nella linea A della metropolitana, le vecchie MA100 che vi prestavano servizio hanno iniziato a viaggiare, dopo un restyling a cura della Met.Ro., sulla ferrovia Roma-Lido e denominate Freccia del Mare. La fine della sostituzione (per un totale di 19 mezzi) è prevista entro la fine del 2010, con lo scopo di aumentare la frequenza di treni in transito nell'ora di punta e di garantire un collegamento diretto tra Porta San Paolo e Ostia senza fermate intermedie.

Inoltre nei prossimi tre anni, con uno stanziamento complessivo di 53 milioni di euro da parte del Comune di Roma, si procederà alla trasformazione dell’attuale ferrovia in una metropolitana di superficie, anche attraverso l’utilizzo di 6 nuovi treni MA300, prodotti dalla società spagnola CAF, originariamente destinati alla linea A della Metropolitana ed immessi a partire dal giugno 2007, e di 19 Frecce del Mare, così come previsto dagli accordi intercorsi tra Comune di Roma e Regione Lazio.

Sono previste tre fasi d’interventi che si concluderanno nel 2010, in cui si provvederà all'immissione del nuovo materiale rotabile e alla costruzione delle nuova stazioni di Malafede e di Acilia Sud oltre alla totale riprogettazione della stazione di Tor di Valle.

Al termine dei lavori la Lido assumerà le caratteristiche di una vera e propria linea metropolitana, e sarà probabilmente denominata Linea E ^{[citazione necessaria]}.

I primi convogli, nel 1924, effettuano 7 fermate compresi i capolinea. La fermata nelle vicinanze degli scavi si chiama "Ostia" (senza "Antica") e l'attuale "Vitinia" si chiama "Risaro". Nei giorni feriali sono effettuate 7 coppie di corse e nei giorni festivi 3. Il tempo di percorrenza da "Roma San Paolo" a "Marina di Ostia" è di 50 min comprese le soste^[4].

Subito prima della guerra, nel 1939, le fermate sono aumentate di un'unità (Mezzocamino) ed alcuni nomi sono cambiati: abbiamo "Ostia Antica (Scavi)", "Lido di Roma" al posto di Marina di Ostia e "Magliana" diventa "Magliana Ostiense"; le coppie di treni sono salite a 35. Il tempo di percorrenza è sceso a 34 min da "Roma Porta San Paolo" a "Lido di Roma" per i treni omnibus e 26 min per i diretti. ^[5].

Nel 1946 le corse calano a 26 coppie. Il numero delle stazioni rimane immutato ed i tempi di percorrenza variano dai 37 min degli omnibus, ai 32 degli accelerati ed ai 28 min dei diretti^[6].

A metà degli anni '70 (orario 1974) la linea si è arricchita nel frattempo di alcune stazioni intermedie (Tor di Valle, Casal Bernocchi) e altre alla fine: Stella Polare, Castel Fusano e C. Colombo. Non c'è più la fermata di Mezzocamino. Le stazioni da Porta San Paolo al capolinea di Ostia sono in tutto 14. Alcuni nomi sono cambiati: Magliana non è più Ostiense, Risaro è diventato Vitinia e la stazione di Lido di Roma è diventata Lido di Ostia Centro.
L'offerta diviene molto più ampia. Esistono due tipi di percorso: i treni che partono da Termini e quelli che partono invece da Porta San Paolo. In totale l'offerta si avvicina alle 90 coppie di treni.

I primi effettuano anche tutte la stazioni dell'allora unica metropolitana di Roma, non ancora linea B, per poi proseguire una volta arrivati a Magliana (non più Ostiense) sul percorso della ferrovia Roma - Lido. Il tempo di percorrenza da Termini a Lido Centro è di 30 min che diventano 37 per chi arriva a Lido Cristoforo Colombo. Tra le nuove stazioni di questo servizio ci sono Garbatella e San Paolo Basilica.

I treni che partono da Porta San Paolo effettuano la prima fermata a Magliana . Il tempo di percorrenza da Porta San Paolo a Lido Centro è di 30 min che diventano 37 per chi arriva a Lido Cristoforo Colombo. Alcuni convogli, denominati diretti impiegano 21 min per arrivare a Lido Centro e 28 per Colombo^[7].

Nell'orario del 2006 le stazioni sono 13: non c'è più la fermata di Torrino ma è stata aperta quella di Lido Nord. "Magliana" ha cambiato nome: EUR Magliana. L'offerta è di quasi 100 coppie tra treni solo feriali, solo festivi e corse quotidiane. Il tempo è di 30 min fino a Lido Centro e di 37 min fino a Colombo^[8].

La prima (gruppo 910) fu usata fino al giugno 1925, quando l'esercizio divenne completamente elettrico.

Le altre due erano delle piccole locotender di manovra, acquistate nel 1938 dalle FS, precedentemente appartenute alla Società Veneta, dove avevano la numerazione 81 e 82^[9].

Locomotore 05 al museo della MetRo Spa, alla stazione di Porta San Paolo, dopo le trasformazioni del dopoguerra.

I primi sei locomotori furono forniti verso la fine del 1924, assieme a cinque elettromotrici e a carri e carrozze. Nel 1926 ne furono forniti altri due. Furono numerati con numeri progressivi da 01 a 08.

Erano stati costruiti dalla Carminati & Toselli e l'equipaggiamento elettrico era della Tecnomasio.

I locomotori pesavano 45 tonnellate ed erano dotati di motori tetrapolari da 230 cv. Le cabine di guida erano poste alle due estremità.

Nel 1934 il numero dei locomotori salì a nove con l'acquisto di uno nuovo uguale ai precedenti.

Dopo la guerra, tra il 1947 ed il 1949, i locomotori hanno subite profonde trasformazione, in particolare con la creazione, alle estremità delle casse, di due cofani per le sabbiere ed i reostati delle batterie, che ne hanno modificato sostanzialmente l'aspetto.

Il locomotore numerato 09 fu modificato nel 1952 ed assunse un aspetto molto diverso per la sagoma più lunga e la conseguente assenza dei cofani alle estremità.

Nell'agosto 1932 fu sperimentata una auto-motrice su pneumatici, progettata dalla Michelin. Era mossa da un motore Diesel da 3500 cc². In Francia era chiamata Micheline.

Ne dava notizia "Le vie d'Italia", la rivista mensile del Touring Club Italiano^[10].

Nonostante i buoni risultati l'esperimento non ebbe seguito.

Nel 1948 e nel 1966 la STEFER ha acquistato due locomotori Diesel per i servizi di emergenza, targate rispettivamente D 51 e D 52.

Il D 51 è stato acquistato nel 1948 contemporaneamente alla cessione di una delle Locomotive a vapore al porto di Genova^[11]. Il locomotore è stato acquistato usato dalle F.S., dove faceva parte del gruppo 213. È un Köf II costruito nel 1940 dalla Deutz AG.

Il D 52 è stato comprato usato nel 1966. È simile alla V50 delle Deutsche Bahn. Costruito nel 1952 dalla Deutz-Greco, ha un rodiggio 0 - 3 - 0, una lunghezza totale di 9570 cm, una potenza di 400 CV ed una velocità max di 50 km/h^[12].

• Nuova stazione ad "Acilia Sud" e potenziamento impianti fissi )

• Nuova stazione "Malafede - Giardini di Roma"